НОВІТНІ ПІДХОДИ ДО лікування онкологічних захворювань: протипухлинний препарат НА ОСНОВІ ГЕН-СПРЯМОВАНИХ нуклеїнових кислот - тема наукової статті з медицини і охорони здоров'я, читайте безкоштовно текст науково-дослідної роботи в електронній бібліотеці КіберЛенінка

           ? УДК 577.218: 616-006Новейшіе підходи до лікування онкологічних захворювань: протипухлинні препарати на основі ген-спрямованих нуклеїнових кислот О. А. Патутіна, Н. Л. Миронова, В. В. Власов, М. А. Зенкова * Інститут хімічної біології і фундаментальної медицини СО РАН, 630090, Новосибірськ, просп. ак. Лаврентьєва, 8 * E-mail: marzen @ niboch. nsc. ru РЕФЕРАТ На сьогоднішній день основним способом боротьби з онкологічними захворюваннями залишається хіміотерапія. Цей метод лікування перебуває на піку своїх можливостей, тому крім удосконалення традиційних способів терапії неоплазій назріла нагальна необхідність розробки нових підходів до лікування злоякісних захворювань. У даному огляді розглянуті інноваційні експериментальні підходи до терапії злоякісних новоутворень, засновані на застосуванні ген-спрямованих препаратів, таких як антисмислової олігонуклеотиди (as ON), малі интерферирующие РНК (si PHK), рибозими і ДНКазіми, здатні пригнічувати експресію онкогенів. Детально охарактеризовані гени-мішені для таких препаратів і підсумовані основні результати преклініческіх і перші етапи клінічних досліджень в цьому напрямку. Показано, що ген-спрямовані олігонуклеотиди, залежно від обраного гена-мішені, відрізняються значною різноманітністю модулирующих ефектів на пухлинні тканини, починаючи від уповільнення і зупинки проліферації пухлинних клітин і закінчуючи придушенням їх інвазивних властивостей. Незважаючи на загальну природу, не всі антисмислової ген-спрямовані препарати, адресовані до одного і того ж ділянки послідовності м РНК гена-мішені, однаково ефективні. Результат визначається поєднанням типу препарату і ділянки його комплементарності в послідовності м РНК для обраного гена-мішені. Ключові слова: протипухлинна терапія, антисмислової олігонуклеотиди, рибозими, ДНКазіми, малі интерферирующие РНК. Список скорочень: as ON - антисмислової олігонуклеотиди, si PНK - малі интерферирующие РНК, РНКі - РНК інтерференція. ВВЕДЕНІЕтим стандартом лікування онкологічних хворих, успіхи На сучасному етапі розвитку медицини пріоритетною якого дозволили збільшити виживаність пацієнтів завданням практичної онкології є підвищення ефек у 8 разів за останні 30 років. Незадовільні ре-фективности лікування злоякісних новоутворень результати тільки хірургічного лікування проявляються шляхом пошуку і розробки принципово нових методи- у вигляді рецидивів пухлини, появи метастазів, а також чеських підходів, а також удосконалення тради- виникнення неоперабельних форм злоякісних онних способів терапії неоплазій. Поєднання хірургії, захворювань. Це змушує звертатися до застосування радіаційного опромінення та хіміотерапії залишається золо- радіо- і хіміотерапії. Однак навіть комбінація мощнихпротівоопухолевих програм у багатьох випадках виявляється бездіяльною. Тому, незважаючи на безумовні досягнення сучасної онкології, проблема підвищення ефективності методів впливу на злоякісні новоутворення є вкрай важливою. За кілька останніх десятиліть комплексна хіміотерапія стала основним методом лікування пацієнтів, які страждають від злоякісних захворювань. Проте її застосування, забезпечуючи виживаність від 30 до 90% хворих в залежності від типу онкопатології, обмежено низкою факторів: системної токсичністю, відсутністю селективності по відношенню до пухлинних тканин і появою лікарсько-стійких клонів пухлинних клітин. Досягнення останніх років збагатили науку детальними знаннями молекулярних процесів, що лежать в основі канцерогенезу, пухлинної інвазії, ангіогенезу і метастазує-вання, а також явищ, залучених до супрессию пухлини, контроль росту, апоптоз і імунну відповідь. Для хіміотерапії неоплазій ці знання дозволили розробити цілі покоління нових препаратів, таких як глевек (Gleevec, Glivec або Imatinib mesylate), мабтера (Mabthera або Rituximab) і т. П., Що володіють високоселективним впливом на клітинну мішень. Відомо, що створення будь-якого нового препарату вимагає 10-20 років досліджень, а збільшення його селективності багато разів підвищує його вартість. Сьогодні хіміотерапія - ця високодозової активна атака на пухлинні клітини - знаходиться на межі своїх можливостей. Незважаючи на досягнутий рівень виживання пацієнтів (при деяких нозологічних формах він збільшився за останні 20 років у 10 разів) залишається ще від 10 до 70% хворих, які в силу різних факторів не реагують на лікування. Таким чином, створення нових засобів є актуальним завданням сьогоднішнього і завтрашніх днів. Серед різних класів розроблюваних лікарських засобів для лікування онкопатологій особливе місце займають ген-спрямовані препарати. Вперше можливість інгібування експресії гена була показана в піонерських роботах Гриньової Н. І. з співавторами і отримала свій подальший розвиток в рамках ідеї регуляції експресії генів, залучених в канцерогенез, під дією антисмислових і ген-спрямованих олігонуклеотидів. Сьогодні основні течії ген-спрямованої терапії злоякісних захворювань включають стратегії придушення гіперекспрессіі онкогенов, відновлення експресії генів-супресорів пухлин, потенціірованія активності імунної системи, придушення процесів ангіогенезу і ме-тастазірованія, запуску самодеструкції пухлини. У даному огляді розглянуто сучасні експериментальні підходи до лікування онкологічних захворювань, засновані на використанні ген-спрямованих олігонуклеотидів, які досліджуються в даний час в експериментах на клітинах і на лабораторних тваринах, деякі з них проходять різні стадії клінічних випробувань. ПРИНЦИП ДІЇ ГЕН-СПРЯМОВАНИХ нуклеїнових кислот Протипухлинні препарати на основі нуклеїнових кислот являють собою високоспецифічний інструмент модуляції експресії генів і давно прівлекаютвніманіе дослідників в якості регуляторів канцерогенезу на молекулярному рівні. Придушення ряду генів, аномально висока експресія яких виникає при неопластичної трансформації, можна здійснити за допомогою препаратів на основі нуклеїнових кислот, таких як антисмислової олігонуклеотиди (as ON), малі интерферирующие РНК (si PHK), рибозими і дезоксірі-бозіми. Загалом, механізм придушення експресії генів під дією цих препаратів полягає в їх комплементарном зв'язуванні з м РНК-мішенню, після чого цільова м РНК або піддається розщепленню, або блокується процес її трансляції. as ON являють собою синтетичні одноцепочной ДНК довжиною 15-20 нуклеотидів, які здатні формувати комплементарний комплекс з цільовою послідовністю м РНК. Придушення біосинтезу білка під дією as ON відбувається або внаслідок того, що м РНК-мішень у складі гібридного ДНК / РНК комплексу з as ON розщеплюється внутрішньоклітинної РНКази Н (рис. 1а), або внаслідок блокування трансляції, так як освіта гібридного комплексу перешкоджає просуванню рибосоми по м РНК (рис. 1б). Останнім часом були отримані as ON, здатні перешкоджати транспорту сплайсірованной м РНК з ядра в цитоплазму, а також as ON, які в результаті блокування сайту сплайсингу в пре-м РНК здатні приводити до експресії альтернативного варіанту білка. Вперше можливість виборчого придушення продукції певного білка під дією as ON була продемонстрована в роботі Замечнік і Стефенсона в 1978 р, в якій вони показали, що 13-ланок олигонуклеотид, комплементарний 3 -концевой послідовності РНК вірусу саркоми Рауса, інгібує реплікацію вірусу in vitro. Ця робота послужила поштовхом до вивчення потенціалу as ON в якості терапевтичних засобів для лікування онкологічних та вірусних захворювань, запальних процесів, хвороб крові, розладів серцево-судинної системи. З огляду на те, що природні олігодезоксирибонуклеотиди в культурі клітин і в умовах in vivo піддаються швидкої деградації під дією нуклеаз, as ONРНКаза Hм РНК-мішень Блокірованіетрансляцій Рис. 1. Механізми дії антисмислових олігонуклеотидів ^ Про ^: а - розщеплення РНК у складі гетеродуплекса з as ON РНКази Н; б - блокування трансляції за рахунок зв'язування олигонуклеотида з м РНКдля підвищення їх стабільності в структуру as ON вводять різні хімічні модифікації. Введення модифікацій в структуру олигонуклеотида не тільки призводить до підвищення стійкості as ON до нуклеаз, але і збільшує ефективність його біологічної дії, покращує його гібридизаційним властивості і полегшує його захоплення клітинами. Серед найбільш значущих похідних антисмислових олігонуклеотидів необхідно згадати тіофосфатние олігонуклеотиди, у яких один з атомів кисню, що не бере участь у формуванні фосфодіефірних зв'язку, замінений на атом сірки. Тіофосфатние as ON мають підвищену стійкість до дії нуклеаз, хорошою розчинність, хорошими гібридизаційним властивостями і утворюють з м РНК гетеродуплекс, який є субстратом РНКази Н. Недоліком тіофосфатних as ON є їх підвищену спорідненість до ряду білків. Друге покоління as ON містило алкільні заступники в 2'-положенні рибози: 2'-О-метильние і 2'-О-метоксіетільние олігорібонуклеотіди ефективно блокували трансляцію м РНК, але не активували розщеплення гетеродуплекса м РНК / as ON РНКази Н. Пізніше Нільсен зі співавторами замінили сахарофосфатний остов нуклеїнової кислоти на П- (2'-аміноетил) -гліцін полиамидную структуру, що дало початок пептидил-нуклеїнових кислот (PNA). PNA мають високу біологічну стабільністю і хорошими гібридизаційним властивостями, однак вони не активують РНКаза Н. Крім того, PNA є нейтральними молекулами, що створює певні труднощі при їх розчиненні і проникненні в клітини. До as ON третього покоління, крім PNA, відносяться N3'-N5'-фосфороамідати (NP), в яких в 2'-дезоксирибози З'-гідроксильна група замінена на З'-аміногрупу і морфоліно-олігонуклеотиди (MF), основу скелета в яких складають морфолин і діметіламідофосфітний линкер. Молекулярний механізм дії цих олігонуклеотидів полягає в блокуванні трансляції за рахунок зв'язування as ON з цільовою м РНК і / або модуляції сплайсингу. NP і MF олігонуклеотиди застосовують переважно для вивчення біології розвитку на ембріонах смугастих даніо (danio rerio, або zebra-fish). Одними з найбільш багатообіцяючих хімічно модифікованих аналогів олігонуклеотидів є LNA (Locked Nucleic Acids) - олігонуклеотиди, що містять додатковий структурний елемент -2'-О, 4'-С-метиленовий місток, що фіксує цукровий залишок у СЗ'-ендо- конформації. LNA проявляють стабільність до нуклеазного розщепленню і володіють виключно високою спорідненістю до нуклеїнових кислот. Перспективність використання LNA in vivo підтверджується тим, що вони відрізняються надзвичайно низькою токсичністю при внутрішньовенному введенні, а також при Мікроін'єкції в мозок тварин. Явище РНК інтерференції (РНКі) вперше було відкрито у хробака Caenorhabditis elegans (C. elegans) як біологічний відповідь на екзогенну двуцепочную РНК (дц РНК), яка индуцировала специфічне придушення експресії гена (gene silencing). РНКі представляє со-бой еволюційно консервативний механізм, завдяки якому організм здатний захистити себе від впровадження чужорідної РНК, наприклад вірусної. Екзогенна дц РНК при попаданні в організм процесує в малі интерферирующие РНК (si PHK - small interfering RNA) під дією внутрішньоклітинної рібонуклеази Dicer. Ці si PHK довжиною 21-22 нуклеотиду потім включаються в мультібелковий комплекс RISC (RNA-induced silencing complex). si PHK в складі комплексу RISC специфічно зв'язуються з комплементарної послідовністю м РНК, після чого відбувається розщеплення м РНК за допомогою внутрішньоклітинної рібонуклеази Argonaute 2, що входить в комплекс RISC (рис. 2). Далі молекули si PHK повторно використовуються комплексом RISC для руйнування наступній молекули гомологичной їм м РНК, забезпечуючи тим самим високоефективне пригнічення експресії гена. Специфічне придушення експресії гена може бути досягнуто за допомогою хімічно синтезованих si PHK або si PHK, отриманих ферментативно in vitro, а також за допомогою коротких шпилькових PHK - sh PHK (short hairpin RNA), експресуються Dicer Рис. 2. Механізм РНК-інтерференції Довга дц РНКsi PHKRISCATPADP + Pi IРазрушеніем РНКв клітці з ДНК матриць, які можуть бути отримані за допомогою ПЛР або включені до складу ДНК векторів. У 80-х роках минулого століття були виявлені каталітичні молекули РНК, здатні розщеплювати РНК, -рібозіми. Існуючі в природі каталітичні РНК дослідники ділять на великі і малі рибозими. Великі рибозими включають РНК, що кодують інтрони I і II груп, а також РНК субодиниці РНКази Р. Малі рибозими включають рибозими типу «головки молотка», шпилькові рибозими, рибозими вірусу гепатиту D і рибозими сателітної РНК Варкуда (Varkud Satellite RNA). Розщеплення РНК рібозімамі протікає в 3 етапи: зв'язування рибозима з комплементарною послідовністю РНК шляхом формування класичних Уотсон-Криковських пар основ, сайт-специфічне розщеплення РНК-субстрату і вивільнення продуктів розщеплення (рис. 3а). Практично всі типи рибозимов проходять дослідження в якості терапевтичних препаратів, проте рибо-зими типу «головки молотка» застосовуються більш широко завдяки їх більшій вивченості. Цей Рибозим розщеплює РНК-мішень переважно по триплети NUH (N - будь нуклеотид; H - будь нуклеотид, крім гуанозіна), причому послідовності AUC і GUC про-цессіруются найбільш ефективно. Іншим часто вживаним в терапевтичних дослідженнях рибозімом є Рибозим у формі шпильки. Рибозим у формі шпильки розщеплює РНК-субстрат по послідовності N * GUC (N - будь нуклеотид). Природні молекули ДНК, що володіють ферментативною активністю, на відміну від рибозимов, в природі виявлені не були. У 1997 році Санторо і Джойс, використовуючи метод селекції in vitro (SELEX), отримали олігодезоксі-рибонуклеотиди, здатні каталізувати розщеплення РНК. Ці молекули були названі дезоксірібозімамі або «10-23» ДНКазімамі. «10-23» ДНКазіми являють собою одноцепочной молекули ДНК, до складу яких входить консервативний каталітичний кор довжиною в 15 нуклеотидів, фланковані двома варіабельними послідовностями олігодезоксірібонуклеотідов, що відповідають за освіту комплементарного комплексу з РНК-мішенню (рис. 3б). Розщеплення молекули РНК відбувається між неспареним пурином і спареним піримідинів в присутності іонів магнію, при цьому найбільш ефективне розщеплення відбувається по Au і Gu сайтам. гени-мішені для лікарських препаратів на основі ген-спрямованих нуклеїнових кислот Ключову роль в онкогенезі відіграють зміни рівнів активності певних генів, аномальна експресія яких призводить до порушень регуляції клітинної проліферації, апоптозу, диференціювання, інвазії. На молекулярному рівні процес злоякісної трансформації являє собою складний каскад реакцій, тому діяльність онкогенов часто багатофункціональна і тісно взаємопов'язана. Будучи транскрипційними факторами і компонентами системи передачі сигналів в клітці, вони залучені в цілий ряд регуляторних шляхів, починаючи від проліферації клітин та інгібування апоптозу і закінчуючи інвазією. Основні гени-мішені для ген-спрямованої терапії представлені в табл. 1. А РІБОЗІМБ ДЕЗОКСІРІБОЗІМм РНК-мішеньм РНК-мішень / г Руйнуванням РНКРазрушеніем РНКАктівний Рибозим Активний дезоксирибоза Рис. 3. Механізм дії рибозимов (а) і ДНКазімов (б) Перш за все, злоякісний ріст клітин заснований на автономною і необмеженої проліферації клітинного клону. Тому дослідників в першу чергу приваблюють гени, які контролюють проліферацію і зміну фаз клітинного циклу, такі як c-myc, ras, гени, що кодують протеїн С-а (PKC-а - proteinkinase С-а), рецептор інсулін-подібного фактору росту-1 (IGF-1R -insulin growth factor-1 receptor). Вплив на системи програмованої загибелі клітин шляхом інгібування експресії антиапоптотических генів, таких як bcl-2, сурвівіна та інших, представляється також надзвичайно ефективним. Білки сімейства Ras (K-ras, H-ras і N-ras) є одними з найбільш вивчених молекул, що здійснюють передачу сигналу від тірозінкіназной рецепторів в ядро ??клітини. В результаті гіперекспрессіі або точкової мутації гена ras, виявленої в багатьох типах онкологічних захворювань, білок Ras втрачає здатність де-фосфорилироваться і, таким чином, постійно перебуває в активованому стані, імітуючи і передаючи сигнали, що стимулюють проліферацію і підтримують виживаність пухлинних клітин. событияконференцииинтервьюнанотехнологии—образование%экономика http: // www. У табл. . Acad. Sci. Chem. Opin. Appl. Med. Chem. Acad. Sci. Chem. Chem. Methods. Opin. Acad. Sci. Chem. Med. Chem. Lett. Acad. Sci. Med. Acad. Sci. Med. Acad. Sci. Rev. Res. Oncol. Med. Opin. Chem. Chem. Chem. Chem. Med. Treat. Oncol. Med. Med. J. Med. Sci. et al. Oncol. Rev. канд. наук. Новосибірськ. Res. Chem. Acad. Sci. Chem. Opin. Opin. Acad. Sci. Chem. Acad. Sci. Oncol. J. Med. Res. Chem. Res. Acad. Sci. Med. Chem. Chem. Res. Acad. Sci. Chem. Chem. Chem. Rev. Chem. Med. Clin. Oncol. Acad. Sci. Oncol. Med. // Gut. Med. Oncol. Acad. Sci. Acad. Sci. Chem. Med.